Kanlı agar, mikrobiyoloji laboratuvarlarında sıkça kullanılan zenginleştirilmiş bir besiyeridir. Genellikle %5 oranında koyun veya at kanı ilavesiyle hazırlanan bu ortam, hızlı büyümeyen ve özel besin ihtiyaçları olan "fastidious" bakterilerin üremesi ve teşhisinde hayati rol oynar. Aynı zamanda bakteri türlerinin hemolitik aktivitelerini gözlemlemek için de güçlü bir araçtır.
Bu özel besiyeri, hem tanı testlerinde hem de bakterilerin sınıflandırılmasında kullanılır. Kan hücrelerinin parçalanmasını sağlayan hemolizin varlığını ortaya çıkarması, hekime ve laboratuvar uzmanına önemli mikrobiyolojik ipuçları sunar. Ayrıca farklı türde bakterilerin neden olduğu enfeksiyonların saptanması ve sınıflandırılmasına yardımcı olur.
Kanlı agarın tanımı ve önemi
Kanlı agar nasıl bir besiyeridir?
Kanlı agar, özellikle besinsel olarak fazla talepkâr olan bakteri türlerinin laboratuvar koşullarında büyümesini sağlamak amacıyla geliştirilmiş, zenginleştirilmiş katı bir kültür ortamıdır. Standart agar ortamına, genellikle defibrine koyun ya da at kanı ilavesiyle elde edilir. Bu sayede, ortamda hem ek besin maddeleri sağlanır hem de mikrobiyal enzimlerin etkileşimi gözlemlenebilir.
Agarın katı halde olması, bakteri kolonilerinin yayılmasını engellerken, bakterilerin yaptıkları enzimatik etkilerin de net bir şekilde görünmesini sağlar. Böylece koloniler hem morfolojik olarak hem de biyokimyasal etkilerine göre değerlendirilebilir.
Hangi tür bakteriler için kullanılır?
Kanlı agar, özellikle Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae gibi fastidious bakteri türleri için uygundur. Ayrıca Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes ve Neisseria meningitidis gibi patojenik bakterilerin kültürlenmesinde de sık tercih edilir.
Bu ortam, bakterilerin ürettikleri hemolizin adlı toksinlerin etkilerini de ortaya çıkarır. Böylece bakterilerin hemoliz türleri ayırt edilebilir; bu özellik, özellikle Streptococcus cinsinin sınıflandırılmasında kritik öneme sahiptir.
Kanlı agarın bileşimi
Besiyeri bileşenleri
Kanlı agarın temelini oluşturan besiyeri, genellikle Tryptic Soy Agar veya Columbia Agar olarak bilinen bazal medya üzerine kuruludur. Aşağıdaki tabloda bir kanlı agar besiyerinin tipik bileşenleri gösterilmektedir:
| Bileşen | Miktar (g/L) | Fonksiyonu |
| Pepton | 10.0 | Karbon ve azot kaynağı |
| Tryptose | 10.0 | Aminoasit ve vitamin kaynağı |
| Sodyum klorür | 5.0 | Osmotik denge sağlama |
| Agar | 15.0 | Katılaştırıcı ajan |
Kana neden ihtiyaç duyulur?
Defibrine hayvan kanı, ortamı hem besin yönünden zenginleştirir hem de mikroorganizmaların hemoliz oluşturma kapasitelerini ortaya koymak için kullanılır. Özellikle kırmızı kan hücreleri içerisindeki hemoglobin sayesinde bakteriler çözünebilir demir gibi gelişimleri için gerekli elementlere ulaşabilir.
Ayrıca bakterilerin ayırt edilmesini sağlayan en önemli özellik de kanda bulunan eritrositlerin hemolize uğrayıp uğramamasına göre değişen renk ve açıklık değişimleridir. Bu görsel ayrımlaştırma, hem klinik teşhis hem de laboratuvar sınıflandırması için çok değerlidir.
Kanlı agarın hazırlanışı
Basal ortamın hazırlanması
Kanlı agar hazırlığında ilk adım, bazal medyanın hazırlanmasıdır. Bu adımda genellikle 40 gramlık toz baz, 1 litre distile su içerisinde eritilir. Karışım, içinde tüm bileşenlerin çözündüğünden emin olana kadar karıştırılır ve kaynatılır.
Ardından ortam, otoklavda 121°C’de 15 dakika sterilize edilir. Sterilizasyon, hem mikroorganizmaların uzaklaştırılması hem de hazırlığın güvenliği açısından önemlidir. Hazırlanan baz ortam, 45°C’ye kadar soğumaya bırakılır çünkü daha sıcak olması kanın pıhtılaşmasına neden olur.
Defibrine kanın eklenmesi
Soğuyan bazal ortama, %5 oranında steril, defibrine (pıhtılaştırıcı fibrin içermeyen) kan ilave edilir. İlave sırasında karışım hafifçe çalkalanmalı ve hava kabarcığı oluşumundan kaçınılmalıdır. Bu adımda dikkat edilmesi gereken nokta, enjeksiyon ya da steril pipetle kanın ortama aseptik koşullarda eklenmesidir.
Karışım homojen hale geldikten sonra, petri kutularına dökülür ve ortam yaklaşık 10-15 dakika içinde katılaşır. Plakların üzerine mikrobiyal örnekler aşılanmadan önce yüzeydeki fazla nem, düşük ısıdaki fırınlarda kurutulabilir.
Kanlı agar kullanımı ve uygulama alanları
Fastidious bakteri türlerinin izolasyonu
Kanlı agar, özel besin gereksinimine sahip fastidious bakterilerin izolasyonu için en etkili ortamlardan biridir. Özellikle üst solunum yolu patojenleri arasında yer alan Streptococcus pneumoniae veya Neisseria türleri bu ortamda rahatlıkla çoğalabilir.
Antibiyotik duyarlılık testleri, enfeksiyon takibi, klinik tanı ve bilimsel araştırmalarda kanlı agar sıklıkla tercih edilir. Aynı zamanda mikrobiyolojik analizlerde kolonilerin şekli, rengi ve hemolitik etkisi üzerinden önemli bilgiler sağlanır.
Farklı hemoliz türlerinin gözlemlenmesi
Kanlı agarın öne çıkan özelliklerinden biri, bakterilerin hemoliz yapma yeteneklerinin net bir şekilde gözlemlenebilmesidir. Bakteriler eritrositleri tamamen, kısmen ya da hiç parçalamayabilir. Bu durum, agar plakları üzerindeki renk değişimleriyle anlaşılır.
Bu gözlem sayesinde bakteri türleri ayırt edilebilir. Örneğin, tam hemolize neden olan Streptococcus pyogenes beta hemolitik iken, kısmi hemolize neden olan Streptococcus pneumoniae alfa hemolitiktir. Hiçbir hemolize neden olmayan bakteriler ise gama (veya non-hemolitik) olarak sınıflandırılır.
Hemoliz türleri ve anlamları
Alfa hemoliz
Alfa hemoliz, eritrositlerin tam olarak parçalanmaması durumudur. Bu tür hemolizde agar yüzeyinde koloni çevresinde yeşilimsi veya kahverengimsi bir renk değişimi gözlenir. Bu renk değişimi, hemoglobinin methemoglobine dönüşmesiyle oluşur.
Alfa hemoliz genellikle Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus gibi türlerde görülür. Bu ayrım, özellikle laboratuvar teşhislerinde streptokok gruplarının tiplendirilmesinde yardımcı olur.
Beta hemoliz
Beta hemoliz, eritrositlerin tamamen lizisiyle oluşur. Bu tür hemolizde koloninin etrafında tamamen şeffaf ve berrak bir alan oluşur. Bu etkiyi streptolizin gibi hemolizin özellikteki ekzotoksinler sağlar.
Beta hemoliz üreten tanınmış bakteriler arasında Streptococcus pyogenes ve Streptococcus agalactiae öne çıkar. Bu türlerin doğru teşhisi, hızlı ve doğru tedavi açısından oldukça önemlidir.
Gamma hemoliz
Gamma hemoliz ya da diğer adıyla non-hemoliz, eritrositlerin hiç parçalanmadığı durumu ifade eder. Bu durumda bakterinin etrafında agar renginde veya yapısında herhangi bir değişiklik görülmez.
Gamma hemoliz gösteren bakteriler arasında Enterococcus faecalis ve Neisseria meningitidis gibi türler yer alır. Bu bilgi türlerin zararsız veya fırsatçı patojen olduğunu göstermek açısından önem arz eder.
