Eosin Methylene Blue (EMB) agar, mikroorganizmaların tanımlanmasında kullanılan seçici ve ayırt edici bir besiyeridir. Genellikle Gram-negatif enterik bakterilerin izolasyonu ve koliform bakteri ayrımı için tercih edilir. EMB agar, farklı bakteri türlerine karşı reaksiyon gösterebilen özel bileşenlere sahip olması sayesinde hem seçici hem de diferansiyel özellik gösterir.
Bakteri türlerine göre koloni rengi, asit üretimi ve morfolojik özellikleri belirgin şekilde farklılık gösterdiğinden, bu ortam klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılır. İçme suyu analizlerinden gıda kontrollerine kadar geniş bir kullanım alanına sahiptir.
EMB Agarın Tanımı ve Kullanım Amacı
EMB agar, özellikle Gram-negatif basillerin izolasyonu ve koliform bakteri ayrımı için geliştirilen bir mikrobiyolojik besiyeridir. Seçici olarak Gram-pozitif bakterilerin büyümesini baskılayarak sadece Gram-negatif mikroorganizmaların gelişimine izin vermesi, bu besiyerini özel kılar. Aynı zamanda içerdiği pH indikatör boyalar ile laktoz fermentasyonu yapan bakterileri ayırmak mümkündür.
Bu özellikleri sayesinde hem çevresel numunelerde (su, toprak, gıda) hem de klinik örneklerde potansiyel patojenlerin belirlenebilmesini sağlar. Escherichia coli gibi kuvvetli laktoz fermenteri bakterilerin koloni görünümü, diğer türlerden kolaylıkla ayırt edilebilir.
EMB Agar Neyi Seçici ve Ayırt Edici Hale Getirir?
EMB agarın seçici özelliği, bileşiminde yer alan eosin Y ve metilen mavisi boyalarının Gram-pozitif bakterilerin büyümesini engellemesiyle sağlanır. Bu iki boya, Gram-negatif bakterilerin gelişimine izin verirken Gram-pozitif bakteri hücre duvarlarını inhibe eder.
Diferansiyel (ayırt edici) özelliği ise ortamda bulunan laktoz ve sükroz şekerlerinin fermantasyon yeteneğine göre bakteri kolonilerinde renk değişimi yaratmasıdır. Asit üreten bakteriler renk değiştirerek kolayca ayırt edilirler.
Hangi Bakterilerin İzolasyonu İçin Kullanılır?
EMB agar; başta Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella ve Pseudomonas türleri olmak üzere birçok Gram-negatif bakteriyi izole etmek için kullanılır. Özellikle koliform bakterilerin tanımlanmasında en etkili yöntemlerden biridir.
Gram-pozitif bakteriler bu ortamda ya hiç büyümez ya da çok zayıf koloniler oluşturur. Bu nedenle Staphylococcus aureus gibi Gram-pozitif bakteriler EMB agar üzerinde büyüyemezler veya soluk renkli küçük koloniler oluştururlar.
EMB Agarın Bileşimi
EMB agarın bileşimi, hem bakteriyel selektivite sağlamak hem de fermentasyon sonucu renk değişimlerini kolaylaştırmak üzere formüle edilmiştir. Aşağıda EMB agarın temel bileşenleri ve görevleri verilmiştir:
Temel Bileşenler ve Görevleri
| İçerik | Fonksiyon |
| Peptik hayvan doku özütü (10 g/L) | Karbon, azot ve büyüme faktörü kaynağı |
| Dipotasyum fosfat (2 g/L) | pH dengesi sağlar |
| Laktoz (5 g/L) | Fermentasyon testi için şeker |
| Sükroz (5 g/L) | Ek karbon kaynağı |
| Eosin Y (0.4 g/L) | pH indikatörü ve Gram-pozitif inhibitörü |
| Metilen mavisi (0.065 g/L) | Gram-pozitif bakterilerin büyümesini engeller |
| Agar (13.5 g/L) | Katı ortam sağlar |
Eosin Y ve Metilen Mavi Boyalarının Rolü
Eosin Y ve metilen mavisi, ortamın hem pH indikatörü hem de selektivite sağlayan ajanlarıdır. Bu boyalar düşük pH'ta renk değiştirerek koloni görünümünü etkiler, ayrıca Gram-pozitif hücrelere toksik etki göstererek onların büyümesini baskılar.
Bu sayede sadece Gram-negatif bakterilerin kolonileri gelişebilir ve gözlemlenebilir. Bu da doğru teşhise önemli katkı sağlar.
Laktoz ve Sükrozun Fermentasyon Etkisi
Laktoz ve sükroz, ortamda bulunan fermantasyon yapılabilir karbon kaynaklarıdır. Laktoz fermentasyonu yapan bakteriler, ortamda asit üretir ve bu asit pH’ı düşürerek boyaların renk değiştirmesine neden olur.
Escherichia coli gibi güçlü fermenterler, koyu mor-siyah koloniler ve yeşil metalik parıltı oluşturur. Zayıf fermenterler açık pembe renkli koloniler yaparken; fermantasyon yapmayanlar ise renksiz veya sarımsı görünür.
Pepton, Fosfat ve Diğer Maddelerin Katkısı
Pepton, bakteriyel büyüme için gerekli olan amino asit ve azot kaynağıdır. Dipotasyum fosfat ise ortamın pH dengesini korur. Bu destek bileşenler, ortamın besleyici özelliğini garanti altına alarak bakterilerin doğru şekilde büyümesini sağlar.
Ayrıca su içeriği ve agar miktarı ortamın kıvamını sağlar. Doğru kıvam, koloni morfolojisinin net gözlenebilmesi için kritik önemdedir.
EMB Agarın Prensibi
Gram Negatif ve Pozitif Bakteriler Üzerindeki Etki Mekanizması
EMB agar, içeriğindeki eosin Y ve metilen mavisi sayesinde Gram-pozitif bakterilerin büyümesini engeller. Genellikle Staphylococcus ve Streptococcus gibi bakteriler bu ortamda gelişemez.
Gram-negatif bakteriler ise emb agar üzerinde çoğalabilir. Bu sayede örnekteki karışık bakteriler içerisinde sadece istenilen grup izole edilebilir — bu da ortamın “seçici” özelliğini oluşturur.
pH İndikatorleri ile Renk Değişimleri
Bakteriler, laktoz ya da sükrozdan asit oluşturduğunda ortamın pH'ı düşer ve boyalar bu değişikliklere renk tepkisi verir. Bu hem kolonilerin rengini hem de parıltısını etkileyen temel mekanizmadır.
- Güçlü fermenterler: Koyu mor veya mavi-siyah koloni + yeşil metalik parlaklık
- Zayıf fermenterler: Açık kahverengi veya pembe renkli koloni
- Fermente etmeyenler: Renksiz veya sarımsı koloni
EMB Agarın Hazırlanışı ve Uygulama Yöntemi
EMB agarın hazırlanışı steril ortamda yapılmalı ve üretim prosedürü dikkatle izlenmelidir. Ortalama hazırlanış aşamaları:
- Ortam bileşenleri 1000 ml saf suda çözülür
- Çözeltinin pH değeri 7.2 ± 0.2 olacak şekilde ayarlanır
- 121°C’de 15 dakika otoklavlanarak steril edilir
- Steril petri kaplarına dökülür ve soğumaya bırakılır
Hazır plaklara saf kültür inoküle edilir ve 24-48 saat boyunca 35-37°C sıcaklıkta inkübasyon yapılır. Plakalar inkübasyon süresince ters çevrilmiş şekilde tutulmalıdır.
EMB Agar Üzerinde Koloni Morfolojisi ve Sonuç Yorumu
EMB ortamında gelişen bakteriler, fermentasyon yeteneklerine göre gözle görülür şekilde farklı kolonilere sahiptir. Aşağıdaki tablo küçük bir karşılaştırmayı özetlemektedir:
| Bakteri Türü | Koloni Görünümü | Fermentasyon |
| Escherichia coli | Mavi-siyah koloni, yeşil parıltı | Güçlü |
| Enterobacter aerogenes | Pembe, mukoid koloni, parıltısız | Orta |
| Salmonella, Shigella | Şeffaf, renksiz koloni | Yok |
| Pseudomonas aeruginosa | Soluk, düzensiz koloni | Yok |
| Gram-pozitif bakteriler | Büyüme yok veya çok az | Yok |
EMB Agarın Kullanım Alanları
İçme Suyu Kalite Kontrolünde Kullanımı
EMB agar, özellikle su analizlerinde koliform bakterilerin varlığını test etmek için kullanılır. E. coli gibi bakteri türlerinin varlığı, fekal kontaminasyon anlamına geldiğinden içme suyu açısından ciddi bir uyarıdır.
Membran filtre tekniği ile birlikte kullanıldığında, su örneğinden elde edilen filtrenin EMB agara yerleştirilmesiyle potansiyel patojenler hızlıca tespit edilebilir.
Salmonella ve Shigella Türlerinin Tanı ve Ayırımı
Salmonella ve Shigella gibi enterik patojenler EMB agar üzerinde renksiz veya soluk koloniler oluşturur. Bu, onları fermentasyon yapan koliformlardan ayırmak için oldukça faydalıdır.
Bu bakteriler genellikle laktoz fermentasyonu gerçekleştirmezler, bu nedenle negatif koloni sonuçları ile tanımlanabilir. EMB agar bu nedenle bağırsak enfeksiyonlarının teşhisinde önemli bir araçtır.
