Besiyeri Hazırlama: Agar Ortamları İçin Kapsamlı Kılavuz
Agar bazlı besiyerleri, mikrobiyolojik araştırmalarda vazgeçilmez bir rol oynamaktadır. Bu ortamlar sayesinde bakteriler, mantarlar ve diğer mikroorganizmalar kontrollü bir şekilde izole edilip incelenebilir. Agar ortamları; laboratuvarlarda gözlemlenebilir koloni yapıları oluşturmak, tanı koymak ve mikrobiyal davranışları incelemek için kritik öneme sahiptir.
Bu rehberde besiyeri hazırlama süreci adım adım ele alınarak; gerekli bileşenler, hazırlama aşamaları, kullanım alanları ve doğru saklama yöntemleri detaylı şekilde açıklanacaktır.
Besiyeri Hazırlama Süreci
1. Hammaddelerin Doğru Miktarlarda Hazırlanması: Başarılı bir agar ortamı hazırlamak için ham maddelerin eksiksiz ve doğru ölçüde hazırlanması kritik öneme sahiptir. En yaygın kullanılan temel bileşenler şunlardır:
- Agar-Agar tozu (%1.5 - %2.0)
- Pepton (%0.5)
- Maya özü (%0.3 - %0.5)
- Glikoz veya başka bir şeker kaynağı (%0.5 - %1.0)
Bu bileşenler dijital hassas terazide gerekli gramajlarda tartılmalı, her biri hazırlanacak ortam miktarına göre orantılı olarak ayarlanmalıdır. Distile su her zaman tercih edilmeli, musluk suyu gibi mikroorganizma içerebilecek kaynaklardan kaçınılmalıdır.
2. Malzemelerin Karıştırılması ve Çözündürülmesi: Bileşenler dikkatlice ölçüldükten sonra kaynama noktasına yakın sıcaklıktaki saf suya eklenmelidir. Karışım iyice çözünene kadar sürekli karıştırma yapılmalıdır. Topak kalmaması için karıştırma sırasında manyetik karıştırıcı veya mekanik karıştırıcı kullanılabilir.
Agarın tamamen çözünmesi genellikle 90-100°C arasında gerçekleşir. Eğer sıcaklık yeterli değilse beklenen kıvam elde edilemeyebilir. Bu aşamada, ortamın net ve homojen bir yapıya sahip olması gerekir.
3. pH Ayarı ve Dengeleme İşlemleri: Standart bir bakteriyolojik agar ortamının pH düzeyi genellikle 7.0 ± 0.2 olmalıdır. Bu değer, çoğu bakterinin optimum büyüme aralığına denk gelir. pH değeri, hassas pH metre yardımıyla ölçülmeli ve gerekirse %0.1 HCl veya NaOH çözeltisiyle ayarlanmalıdır.
Düşük veya yüksek pH ile hazırlanan ortamlar, bazı mikroorganizmaların büyümesini engelleyebilir. Bu nedenle özellikle test edilen mikroorganizma türü göz önüne alınarak hedef pH değeri belirlenmelidir.
4. Sterilizasyon: Yüksek Sıcaklık ve Basınçta İşlem: Karışım tamamlandıktan sonra otoklav ile sterilizasyon yapılmalıdır. Standart sterilizasyon koşulları şu şekildedir:
| Sıcaklık | Süre | Basınç |
| 121°C | 15-20 dakika | 15 psi |
Sterilizasyon süresi, hazırlanan miktara göre ufak farklılıklar gösterebilir. Ancak tamamen steril bir ortam sağlanması, kontaminasyonun önlenmesi açısından kritik öneme sahiptir.
5. Besiyerinin Dökülmesi ve Katılaşması: Sterilizasyon sonrası ortam biraz soğumaya bırakılmalı ve 45-50°C civarında petri kutularına ya da tüplere dökülmelidir. Bu sıcaklık, ortamın hem mikrobiyal bozunmaya karşı dayanıklı olmasını hem de agarın kısa sürede katılaşmasını sağlar.
Oda sıcaklığında 15-30 dakika içinde tam katılaşma gerçekleşir. Döküm işlemi sırasında çalışılan ortam tamamen steril tutulmalı ve kaplar hava akımlarından uzak, temiz bir yüzey üzerine yerleştirilmelidir.
Agar Besiyerinin Bileşenleri
Temel Maddeler: Agar-Agar, Peptonlar, Maya Özü ve Glikoz
Agar-Agar: Katılaştırıcı madde olarak görev yapar ve mikrobiyal kolonilerin gelişimini destekleyici sabit bir yüzey sağlar. Yoğunluğu genellikle %1.5 - %2.0 arasındadır.
Pepton: Protein kaynağı olan pepton, mikroorganizmaların büyümesi için gerekli olan azot bileşiklerini, amino asitleri ve peptitleri barındırır. Kazein veya soya proteininden elde edilebilir.
Maya Özü: Vitamin, mineral ve büyüme faktörleri yönünden zengindir. Mikroorganizmaların hızlı büyümesi için ideal bir bileşendir.
Glikoz: Karbon kaynağı olarak işlev görür. Enerji ihtiyacını karşılayarak mikroorganizmaların metabolizmasını destekler.
Tuzlar, Su ve Opsiyonel Katkı Maddeleri
Tuz (NaCl): Mikroorganizmalar için ozmotik dengeyi sağlar. Çoğunlukla %0.5 oranında kullanılır. İyon dengesine katkı sağlar ve hücre içi – dışı dengesini düzenler.
Su: Tüm bileşenleri çözmek ve ortamın homojen yapıda olmasını sağlamak için kullanılır. Her zaman distile ya da deiyonize su tercih edilmelidir.
Ayrıca aşağıdaki opsiyonel katkı maddeleri de kullanılarak ortamın özelleştirilmesi mümkündür:
- pH İndikatörleri: Bromotimol mavisi, fenol kırmızısı
- Antibiyotikler: Seçici ortamlar için streptomisin veya ampisilin
- Spesifik Besinler: Vitamin, amino asit veya mineraller
Besiyerinin Kullanım Alanları
Bakteri Yetiştiriciliği, Koloni Sayımı ve Suş Saklama
Agar besiyerleri, mikrobiyolojik analizlerin temelini oluşturur. En yaygın kullanım alanı bakteri kültürlerinin üretilmesidir. Yayma, sıvazlama veya nokta inokülasyon yöntemleriyle bakteri kolonileri oluşturulur ve bu kolonilerin özellikleri analiz edilir.
Ayrıca agar ortamları üzerinde gelişen kolonilerin sayımı yapılabilir. Bu yöntemle örneğin 1 mL numunedeki bakteri yoğunluğu hesaplanabilir. Bunun yanında yarı katı agar ortamları, bakteri suşlarının uzun süre saklanmasını kolaylaştırır. Düşük sıcaklıklarda (4°C) muhafaza edilerek genetik özellikleri korunabilir.
Besiyerinin Saklama Koşulları ve Raf Ömrü
Uygun Sıcaklık, Yöntem ve Kontaminasyon Kontrolü
Steril agar ortamlarının bozulmadan saklanabilmesi için ideal koşullar sağlanmalıdır. Genel olarak dökülmüş plaklar 4°C’de saklanmalı ve ışık ile nem temasından korunmalıdır. Kontaminasyon riskine karşı plaklar ters çevrilmiş şekilde konumlandırılmalıdır.
Ev yapımı veya açılmış besiyerleri en fazla 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Fabrikasyon plakalar ise genellikle 1 ila 6 ay arasında dayanabilir. Saklama süresi etiketlenmeli, ortam renk değişimi, küf veya çatlak gibi sorunlara karşı düzenli olarak kontrol edilmelidir.
- Sıcaklık: +2°C ila +8°C arası ideal
- Nem: Ortam nemsiz ve kuru olmalı
- Konum: Buzdolabında fanlardan uzak bir bölgede saklanmalı
